测定原理

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体35mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加10mL双蒸水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。

酶液提取

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g， 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定操作表

图

酶活性计算公式

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性（nmol/min /g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 392×△A÷W

ε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1mL；V样：反应中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min

注意事项

1.测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.色素含量较高的样品，可在提取酶时加活性炭吸附。