产品名称 | 检测方法 | 规格 | 货号 |
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGP)活性测定试剂盒 | 分光光度法 | 25管/24样 | CS-01S63373 |
AGP (EC
测定原理
AGP催化的逆向反应生成G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。
需自备的的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液:液体25mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入9mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入5mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
粗酶液制备
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、试剂一置30℃保温10min以上。
3、在EP管中按顺序加入下列试剂
混匀后,立即于340 nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
AGP活性计算
1、按样本蛋白蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。
AGP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T×稀释倍数
=2813×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T×稀释倍数
=2813×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;稀释倍数:1.4;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。
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