产品及特点 ：

罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是从土壤农杆菌 CP4 菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因，是转 基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因，因此本公司根据探针法 qPCR 原理开发 了专门用于检测罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法），它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。 2. 根据罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法）保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中的罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法）成分，但不能检测其他非罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法）成分。 3. 提供阳性对照，便于区分阴性样品。 4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。 5. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为 2.0 小时。 6. 本只能用于科研，足够 50 次 20uL 体系的探针法荧光定量 PCR。

荧光定量PCR试剂盒制造技术：

罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法）本实用新型专利技术公开了一种实时荧光定量PCR试剂盒，包括盒体，盒体由上盒体和下盒体组成，上盒体的底面上设有限位凸起，下盒体的顶面上设有与限位凸起匹配的凹槽，且在下盒体左右侧壁的下端均软连接有侧盖，侧盖远离下盒体的一端连接有卡勾，下盒体的上端边缘处设有环形凸起，两个卡勾分别勾住环形凸起的左右两端将上盒体固定在下盒体上；凹槽的内部设有固定杆，固定杆上通过转动件转动连接有用于放置试管的试管架；下盒体的左右两侧均设置有收纳槽。本实用新型专利技术通过将盒体分为上下组合的两个部分，并将两个部分通过侧盖连接，即可保证试剂盒的便携性，同时使用试剂盒自带的试管可提高检测的效率。

产品特点

1. 使用化学修饰的热启动聚合酶，反应特异性高，*程度地避免了非特异扩增；

2. 反应缓冲液经充分优化，反应灵敏快速，40个循环只需20多分钟；

3. 抗干扰能力强，反应重复性高，适合对土壤、粪便、肿瘤和血液来源的复杂样本中的靶基因进行检测分析。

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

 特异性荧光标记：

 TaqMan法

 TaqMan探针的特性：

（1）5′端标记有报告基团（Reporter, R），如FAM、VIC等

（2）3′端标记有荧光淬灭基团 （Quencher, Q）

（3）探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光

（4）Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

相对定量通过内标定量：

内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小，内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。

荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

(1)将罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法）参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；

(2)待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。

其中步骤(1)为：将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线。

其中所述参照基因为本领域常规参照基因，较佳地管家基因，优选地为RPPH1的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域常规质粒载体，较佳地为PCR克隆载体，优选地为TA cloning载体，所述TA cloning载体较佳地为pMD18-T载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例较佳地为1：1。由于标准品中待测目的基因与参照基因的比例为1:1，解决了目前相对标准曲线法应用中目的基因与参照基因的浓度比例关系难以控制的问题，提高HER2基因扩增检测的可靠性。

步骤(2)为：待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。

其中所述待测目的基因为本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或者疾病的特异性基因，更佳地为HER2基因的扩增区域，所述荧光定量PCR扩增为本领域常规荧光定量PCR扩增方法，所述荧光定量PCR扩增方法较佳地为多通道荧光定量PCR扩增，更佳地为双通道荧光定量PCR扩增。