白果PCR鉴定试剂盒是放线菌的一种,常常会在耳部等引起感染,感染具有多发性、复发性等特点,难以完全治愈,对人体健康造成较长时间的损害,因此检测白果PCR鉴定试剂盒具有重要的意义。本试剂盒根据荧光定量PCR 原理开发,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。
2. 特异性高,引物是根据白果PCR鉴定试剂盒高度保守区设计,不会扩增其他细菌。
3. 引物和扩增体系经过优化,灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照,便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作,荧光 PCR 检测,不容易产生环境污染。
6. 本产品只能用于科研,本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
使用方法:一、
白果PCR鉴定试剂盒制备标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照(其浓度为 1×10E8 拷贝/μL,试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的 DNA,本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有 N 个样品,则需要进行 N+2 个样品提取,多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。
三、设置 qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果进行定量分析,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析,则 6 个标准曲线样品只选一个做(可以选 4 号,其余样品不变)。
数据处理 11. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
12. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 30。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 25。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 30 则为阴性,如果小于或等于 25 则为阳性。如果在 25-30 之间,则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 30 则为阴性,如果小于 30,则为阳性