英文名称：Protein A Immunoprecipitation Kit

产品规格：20次/100次

发货周期：1～3天

产品简介:

Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及试剂盒系列产品是利用纳米表面技术使Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性微球表面，与当前国际免疫磁珠市场上同类产品相比，该产品具有更多的抗体结合位点，磁珠使用量更少，非特异性结合率低，可便捷高效地进行免疫沉淀实验。每毫升免疫沉淀磁珠结合Human IgG的能力可达到300μg以上，单个沉淀反应仅需25μL磁珠即可完成检测。微米级磁珠提供的超大比表面积，大幅缩短抗体与抗原吸附所需的平衡时间，15 min内即可完成抗体吸附过程，30 min内完成抗原沉淀操作。简短的操作时间避免长时间操作造成目标蛋白水解，保证了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。

免疫沉淀磁珠试剂盒配有经过优化预制的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。

本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。操作者可以参考本操作说明书，附表1的数据了解不同种属来源及亚型的抗体与Protein A磁珠、Protein A/G的结合能力。

储存条件：2～8℃保存 

保存期：1年 

注：磁珠结合Human IgG能力(Antibody Capacity)分别为：Protein A：0.4～0.5 mg/mL; Protein A/G：0.5～0.6 mg/mL 

操作流程：

1. 抗原样品制备：本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。

血清样品处理：若目标蛋白丰度较高，建议用结合缓冲液(②)稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10～100 μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理：离心收集细胞(4℃，500 g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 μL的比例用1× PBS(③)洗涤2次；按每毫克细胞5～10 μL的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM 的PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4℃,14000 g,10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每1.0×105个细胞150 μL的比例用1×PBS(③)洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1.0×105个细胞20～30 μL 的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4℃，14000 g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

大肠杆菌样品处理：离心收集大肠杆菌(4℃，12000 g，2 min)，弃上清后称重，按每克(湿重)菌体 10 mL的比例用1×PBS(③)洗涤2次；按每克(湿重)菌体5～10 mL的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM 的PMSF)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，17000 g，10 min)。

2. 磁珠预处理：将免疫沉淀磁珠(①)漩涡振荡1 min，使磁珠充分振荡重悬；取25～50 μL磁珠悬液置 于1.5 mL EP管中。加入200 μL 结合缓冲液(②)洗涤，进行磁性分离［将EP管放置于磁性分离器(⑦)上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；该操作描述以下省略］，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管，重复洗涤一次。最后加入200 μL 结合缓冲液(②)重悬磁珠以备用。

3. 抗体结合反应：

抗体工作液的制备：用结合缓冲液(②)稀释抗体样品，配制成终浓度为5～50 μg/mL抗体工作液，置于冰上备用。

抗体吸附：将步骤2预处理的磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液；加入200 μL抗体工作液，迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管，15 min后进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。

洗涤：向EP管中加入200 μL 结合缓冲液(②)洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管。重复以上洗涤操作一次。

4. 抗体交联反应 (备选)：如操作者需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，进行步骤5。

本步骤适用于操作者需要单独洗脱目标抗原的试验，推荐使用BS3(Thermo Scientific，Cat. #21580)作为交联剂，相关实验请参照该试剂的操作说明。

5. 抗原沉淀反应 

抗原吸附：加入200 μL步骤1中制备的抗原样品，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管10 min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1 h或者在4℃下反应过夜。

洗涤与转移：将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200 μL 洗涤缓冲液(④)洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁性分离器上取下EP管，再重复洗涤两次。最后加入 200 μL 洗涤缓冲液(④)，用移液器将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP管中*，并执行磁性分离，移弃上清。

(*注：抗原洗脱前务必将磁珠转移到新的EP管，避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱。) 

6. 抗原洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

变性洗脱法：此法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入25 μL 1× SDS-PAGE Loading Buffer(自备)混合均匀，95℃加热5 min。然后执行磁性分离［也可以使用离心的方式(室温下13000 g，10 min)］ 收集上清液进行SDS-PAGE检测。

非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入20 μL 洗脱缓冲液(⑤)混合均匀，室温孵育10 min。然后执行 磁性分离［也可以使用离心的方式(4℃，13000 g，10 min)］，收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 μL中和缓冲液(⑥)将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

注意事项：

1. 进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读本操作说明书。

2. 本产品须与磁性分离器配套使用。

3. 磁珠使用前应充分振荡均匀。

4. 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥。

5. 请勿将磁珠冷冻或离心，以免引起不可逆聚集。