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细胞生物学试剂 > 免疫检测 > ECM Kit(大鼠IgG)
产品名称:
ECM Kit(大鼠IgG)
型号:
CS-C8873
生产地址
进口、国产
产品价格
电议
产品简介
ECM Kit(大鼠IgG)价格优惠、质量保证、欢迎咨询订购!
产品详情

一、概述:

中文名称:ECM Kit(大鼠IgG)
英文名称:
产品规格:1盒
发货周期:1~3天
用途:适于一抗为大鼠IgG的Western Blotting 检测。
保存条件:4℃可保存一年 。
实验操作步骤:
1.蛋白质的样品制备:
1)细胞培养蛋白质样品的制备:
1:胰酶消化后裂解:细胞培养至 80%左右密度时,以含 0.25%胰蛋白酶消化,室温,低速离心,弃上清。细胞经预冷的PBS 漂洗3次,加入 0.1-1ml 裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。
2:皿上直接裂解:细胞培养至 80%左右密度时,细胞经预冷的PBS 漂洗3次,加入 0.1-1ml 裂解液(根据细胞数量定),用细胞刮刀收集,转移至离心管中,反复吹打。
2)组织样品的制备:新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中,漂洗数次,按组织净重:裂解液=1:10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆,离心收集上清(如有粘稠物可超声处理)
3)蛋白变性:处理后的样品加入样品缓冲液(按样品浓度 1:1或1:2的比例)混匀,样品置 1000C的水浴箱加热 3-5分钟,10000g 离心 10分钟,取上清液。(样品可立即使用也可以分装冻存,-20℃可稳定保持数月。)
2.SDS-PAGE 电泳:
1).制 胶:①按比例配制分离胶(丙烯酰胺母液:单体:双体=29:1),缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水或正丁醇,以阻止氧气进入凝胶溶液中,37℃恒温箱中静置 60min。
②同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,以连续平稳的液流注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,37℃恒温箱中静置60min 以上以保证完全聚合。
2)加 样:依次加入标准品和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在 1.0mm 厚的胶 加样 50-100ug/lane)。
3)电 泳:加样完毕,选择适当的电压进行电泳即可。一般采用恒压浓缩胶 55V,分离胶 75V,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳。
3.转 膜:蛋白质经 SDS-PAGE 分离后,从凝胶中转移到固相支持物上,常用的支持物有:硝酸纤维膜即 NC 膜(AR0135)或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 结束后,取出凝胶,在 Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法,包括湿式电转印和干式电转印。
1)干式电转印:将转印槽阴极平放工作台上,并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸,将电转印液浸透 0.45μm的N.C 膜放在滤纸上,再将凝胶平放在 N.C 膜上,最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透 1mm 厚的滤纸,电流根据凝胶面积按 1-2 mA/cm2,接通电源,经 1-1.5 小时电转印。
2)湿式电转印:打开电转印夹,每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫,再各放三块转印液浸透的滤纸,滤纸与海面垫大小相同或与 NC 膜、凝胶大小相同均可,将凝胶平放在阴极侧滤纸上,最后将 NC 膜平放在凝胶上,按照(-)夹板-海棉-滤纸-胶块-NC 膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好,依次除尽每层间气泡,夹好电转印夹。 电泳槽加满预冷电转印液,插入电转印夹,将电泳槽放入冰箱内,连接好电极,接通电流,转印夹的NC 膜应对电泳槽的正极,4℃ 250-300mA,转印 80min(根据
分子量不同,转印时间可适当调整)。
4、膜的封闭:漂洗转印膜,室温,3次 x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS(以免影响抗体的结合),放入 0.02M TBS 缓冲液配置的5%脱脂奶粉和 1%的BSA 混合的封闭液内,摇床摇动,室温封闭 2h或4℃过夜。1×TBS-T ,PH7.6洗
液,室温漂洗10min。
5、抗体杂交:1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中,加入用 0.02M TBS 缓冲液配置的2%脱脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀释液适当稀释的适当稀释的一抗,4℃孵育过夜或37℃孵育2h,1×TBS-T ,PH7.6洗液洗膜 3次 x10min。(一抗的稀释度,孵育时间,温度与显色强度,背景有直接关系。一般来说,阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间,而背景高,非特异性条带多,则降低抗体浓度和孵育时间)。
2)用 0.02M TBS 缓冲液配置的2%脱脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀释液适当稀释过氧化物酶标记兔抗大鼠IgG 孵育膜,20℃-37℃,1.5 小时或4℃过夜,1×TBS-T洗膜 3×10min。
6、显色(ECM)
ECM显色剂配制:按 1ml 蒸馏水,加显色剂 A、B 各 1 滴混匀。将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液反应约 1-5分钟。吸去印迹膜边缘显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,以确保×感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光 30'-5分钟。
7、显影,定影。
 
 
ECM Kit(大鼠IgG)细胞生物学研究有以下几个方面。
细胞生物学的研究内容十分广泛,主要包括。
①细胞核、染色体以及基因表达的研究。
②生物膜与细胞器的研究。
③细胞骨架体系的研究。
④细胞增殖及其调控。
⑤细胞分化及其调控。
⑥细胞的衰老与编程性死亡(凋亡)。
⑦细胞的起源与进化。
⑧细胞工程。

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