英文名称：DAB chromogenic reagent kit For Western Blotting

产品规格：1盒

发货周期：1～3天

工作原理：聚合标记法是一种酶标记方法，其敏感性比普通酶标法有明显提高。用于 Western Blotting的免疫学检测，更能体现其优点。不仅能大量地节约一抗，更重要的是使条带更清晰，甚至能检测出普通酶标法无法检测出的微量条带。DAB 是过氧化物酶最重要的显色剂之一，反应产物为不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物，适合于免疫印迹的显色反应。本产品采用特殊配方，具有操作简单，储存稳定，信号灵敏度高，持续时间长，背景低，结果易保存等优点。

保存条件：－20℃冷冻保存。DAB 显色试剂应避光保存。

有效期：一年。

试剂盒的内容：

(1)封闭试剂：10 g 蛋白干粉×2 包。

(2)浓缩抗体稀释液：20 ml×1 瓶，为10倍浓缩液。

(3)聚合过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG0.2ml，效价 1：200-400。亲和纯化抗体，经聚合法标记过氧化物酶。

(4)DAB 显色试剂，含：

显色剂 A：DAB×40倍浓缩液，3ml。

显色剂 B：H2O2×40倍浓缩液，3ml。

显色剂 C：×40倍 TBS 浓缩缓冲液，3ml。

使用说明：

需要而未提供的试剂和器材：

1．转印了蛋白样品的NC 膜或PVDF 膜：通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质抗原，将 PAG 胶上的蛋白质转印到硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF 膜上。

2．稀释缓冲液：使用中性稀释缓冲液即 0.02 M PBS或0.02M TBS(AR0144)配制封闭液和抗体稀释液。0.02 M PBS(pH7.2-7.6)：1000 ml 蒸馏水加 Na2HPO4 2.8 g ，NaH2PO4 0.4 g，NaCl 8.5 g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。0.02M TBS(pH7.2-7.6)：1000ml 蒸馏水中加 Tris 2.42g,NaCl 9g; 纯乙酸或浓盐酸调节 pH 值(7.2-7.6)。

3．洗涤缓冲液：每 1000ml 中性稀释缓冲液中加入 0.5 ml Tween20 即可。

4．一抗：选择适合的一抗，用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体工作浓度为1μg/ml,具体的稀释度取决于特异性的一抗和膜上的抗原的量。

5．摇床：膜的封闭、抗体孵育和洗涤都需平稳摇晃，需在摇床上操作。

6．相机：记录结果。

操作程序：

1．通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样本和分子量标准。

2．将蛋白样本转移至硝酸纤维素膜或PVDF 膜上。

3．封闭硝酸纤维膜：用封闭蛋白干粉 2 g,加稀释缓冲液 100 ml，20-37℃封闭 1-2 小时。用量以浸没整张膜为准。

4．用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 5分钟,1次。

5．配制抗体稀释液：取 90 ml 稀释缓冲液加 1 g 封闭蛋白干粉和 10 ml浓缩抗体稀释液即可。一抗、二抗均用此稀释液稀释。

6．硝酸纤维膜孵育一抗：用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体浓度 1μg/ml,20-37℃孵育2 小时左右。如果缺乏特异性的条带或阳性不强，应提高一抗的浓度；如果有非特异性的条带，应提高一抗的稀释度。

7．用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜 3次,每次 5分钟。

8．硝酸纤维膜孵育二抗：用抗体稀释液稀释相应的酶标二抗，效价 1：200-400。37℃孵育一个半小时左右。用户可根据实际染色情况对稀释度做适当调整。

9．用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维膜 4次,每次 5分钟。

10．DAB 显色:使用 DAB 显色试剂。按每 2 ml 蒸馏水加显色剂 A，B，C 各１滴，混匀。混匀后加至膜上。室温显色。一般显色 1－30分钟。

若无背景出现则可继续显色。显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。

11．观察，照相。

注意事项：