保存条件：-20℃冰冻保存。

保存期：一年

工作原理：

在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA 被切割，出现单链或双链缺口，并产生与 DNA 断点数目相同的3’-OH 末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以将地高辛标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 结合在 DNA 断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合荧光素 FITC或者过氧化物酶 POD 标记的链酶亲和素(SABC-FITC/SABC-POD)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 发射荧光，在荧光显微镜下呈明亮黄绿色。POD的在加入显色底物 DAB 显色后，凋亡的细胞核呈棕黄色。用户根据实验需要，在不同切片上用两套不同显示系统观察。

试剂盒内容：

1．标记缓冲液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封闭液(Blocking Reagent)4ml

5．生物素化抗地高辛抗体(× 100)20μl

6．SABC-FITC(× 100)20μl

7．SABC-POD(× 100)20μl

8．Proteinase K(×200)50μl

9．抗体稀释液 4ml

10．未染色阳性对照片 2 张。

用户自备试剂：

1．多聚赖氨酸或APES。

2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克 Tris和0.45—0.5ml纯乙酸。)

3．水溶性封片剂。

操作步骤：

1．样品处理

(1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES 进行处理。

(2)细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室温下固定 30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤 2分钟×2次。

(3)组织：有条件时应及时固定。常规 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。

2．标本片加 0.01M TBS 1:200 新鲜稀释 Proteinase K 37℃消化 1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化 10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化 5-10分钟。陈旧石蜡切片消化 10-15分钟)。

3．标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片湿润。按每张切片取 TdT和DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。

4．0.01M TBS洗2分钟×3次。

5．加封闭液 50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。

6．用抗体稀释液 1：100 稀释生物素化抗地高辛抗体：(取 1ml 抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl)，混匀后 50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。

7．用抗体稀释液 1：100 稀释 SABC-FITC/(SABC-POD)：取 1ml 抗体稀释液加 SABC-FITC/(SABC-POD 10μl，混匀后 50μl/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。

8．加 SABC-FITC的在荧光显微镜下用蓝色光激发观察。

9．加 SABC-POD的，可选用 DAB 显色：取 1ml 蒸馏水，分别加入 DAB 试剂盒中 A，B，C 试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色 10-30分钟左右。水洗。

10．苏木素轻度复染。0.01M TBS洗，蒸馏水洗。水溶性封片剂封片。

结果判定：

荧光显微镜下：细胞核中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

普通显微镜下：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项：

1.试剂盒严格-20℃存放。

2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 5分钟，使试剂沉至管底。

3.检测过程中切勿使样品干涸。