保存条件：-20℃冰冻保存一年。

工作原理：

在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内 源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA 被切割，出现单链或双链缺口，并产生 与 DNA 断点数目相同的3’-OH 末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以将地高辛标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 结 合在 DNA 断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合 链酶亲和素-荧光素 CY3(SABC-CY3)。Cy3 在 554nm 激化，在 568-574nm 发射荧光，呈鲜红色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。

试剂盒内容：

1．标记缓冲液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封闭液(Blocking Reagent)4ml

5．生物素化抗地高辛抗体(× 100)20μl

6．SABC-CY3(× 100)20μl

7．Proteinase K(×200)50μl

8 抗体稀释液 4ml

阳性对照片 2 张

用户自备试剂

1．多聚赖氨酸或APES。

2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5 克氯化钠,1.2 克 Tris和0.45—0.5ml 纯 乙酸。)

3．DAPI 染色液

4．水溶性封片剂或抗荧光衰减封片剂。

操作步骤

1．样品处理

(1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES 进行处理。

(2)细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01MPBS(PH7.0---7.6)室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。

(3)组织：有条件时应及时固定。常规 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲 福尔马林固定 4 小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。

2．标本片加 0.01M TBS 1:200 新鲜稀释 Proteinase K 37℃消化 1—15分钟,0.01MTBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化 10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化 5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。

3．标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT和 DIG-d-UTP 各 1μl ，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加 标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。

4．0.01M TBS洗2分钟×3次。

5．加封闭液 50μl/片，室温 30分钟，甩掉封闭液，不洗。

6．用抗体稀释液 1：100 稀释生物素化抗地高辛抗体：(取 1ml 抗体稀释液加生物素化抗地 高辛抗体 10μl)，混匀后 50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。

7．用抗体稀释液 1：100 稀释 SABC：取 1ml 抗体稀释液加 SABC 10μl ，混匀后50μl/ 片加至切片。37℃反应 30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。

8．必要时可用 DAPI 染色液(货号 AR1176，AR1177)轻度复染，蒸馏水洗。抗荧光衰减封 片剂封片(可用甘油代替)。荧光显微镜观察。

结果判定：细胞核中有鲜红色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。

注意事项：

1．试剂盒严格-20℃存放。

2．初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 5分钟，使试剂沉至管底。

3．检测过程中切勿使样品干涸。