Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用荧光素APC标记的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生,可用流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。
其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
另外,本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料,同PI有着相似的荧光特性,但其发射光谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品,可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V-APC与7-AAD联合使用时,7-AAD则被排除在活细胞(Annexin V-/7-AAD-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/7-AAD-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-APC和7-AAD结合染色呈现双阳性(Annexin V+/7-AAD+)。
试剂盒组份:
重组人Annexin V/APC*(rh Annexin V/APC)———100µl
7-AAD Viability Staining Solution——————100µl
1×Binding buffer——————————————10ml
注意事项
1) 试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2) 7-AAD为潜在致癌物,操作时请采取防护措施,穿防护服、戴手套等;
3) 推荐使用悬浮培养细胞。若是贴壁细胞,建议使用不含EDTA的胰酶消化,如果消化不当,可能引起假阳性;若用细胞刮子则会造成细胞黏连成团而影响检测。可将胰酶消化后的细胞保存于含2% BSA的PBS中,防止进一步的损伤。
4) 本试剂盒适用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不应低于1×105,不推荐用于组织样本检测。
5) 请勿固定样品,细胞固定后可能导致荧光的猝灭;
6) 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同,因而流式检测的荧光补偿也不同,因此建议每次检测均需使用未经凋亡细胞处理的细胞作为阴性对照,并进行荧光补偿的调节。
7) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并低速离心(200×g)洗去血小板,然后用Annexin V结合缓冲液清洗细胞,以避免残留的EDTA会螯合Ca2+。
8) Annexin V-APC和7-AAD是光敏物质,在操作时请注意避光。
9) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
储存条件:4℃,有效期一年。